常規(guī)高通量測序的文庫構(gòu)建，需要PCR擴增。主要是為了對微量DNA樣本進(jìn)行擴增，提高庫容；另一方面，放大核酸熒光信號，提高測序準(zhǔn)確度。然而，PCR擴增同樣也有著無法忽視一些問題：

1.      擴增過程中產(chǎn)生復(fù)制錯誤，累積下去，產(chǎn)生假陽性；

2.      擴增會有一定的偏好性，比如GC含量異常的區(qū)域和二級結(jié)構(gòu)等區(qū)域，擴增效率低，難以覆蓋；

3.      擴增的循環(huán)數(shù)越多，重復(fù)率（Duplication）越高，造成測序成本增加、浪費測序數(shù)據(jù)。

什么是PCR-Free技術(shù)

常規(guī)擴增建庫有諸多問題，那么PCR-Free技術(shù)也就營運而生。PCR-Free技術(shù)，相較于常規(guī)建庫，其建庫步驟為：基因組片段化-末端修復(fù)-加接頭-純化-文庫質(zhì)控，省去了PCR擴增的步驟。

1.      PCR-Free建庫技術(shù)：

2.      省去擴增步驟，縮短建庫時間；

3.      避免使用高保真聚合酶，降低建庫成本；

4.      減少擴增產(chǎn)生的復(fù)制錯誤；

5.      避免擴增偏好性；

6.      避免擴增產(chǎn)生的Duplication，降低測序成本。

llumina DNA PCR-Free Prep，Tagmentation DNA建庫即運用了PCR-free的建庫方式，并同時采用創(chuàng)新型鏈接在磁珠上的轉(zhuǎn)座酶（BLT），將接頭連接和DNA 片段化結(jié)合到一個簡單快速的反應(yīng)中，實現(xiàn)WGS高度均勻的覆蓋。

針對PCR-Free建庫方法，我們推出了基于Biomek i7工作站的Illumina DNA PCR free文庫構(gòu)建自動化方案，該方案可使用低投入量（25-99ng）或標(biāo)準(zhǔn)投入量（100-2000ng）gDNA進(jìn)行建庫，同時進(jìn)行96例樣本的建庫。

·        減少手動操作時間

·        減少系統(tǒng)設(shè)置何潛在的移液錯誤

·        標(biāo)準(zhǔn)化工作流程改進(jìn)實驗結(jié)果

·        快速安裝

Biomek i7工作站

圖1. Biomek i7 Hybrid Genomics Workstation工作桌面

·        集成了96通道移液頭與靈活8通道移液頭；

·        靈活8通道可配置固定針和可替換吸頭通道搭配；

·        96通道可選擇上一列、一行、多行等不規(guī)則形狀排列吸頭，實現(xiàn)不定樣本數(shù)液體轉(zhuǎn)移；

·        斜側(cè)抓板機械手可360度旋轉(zhuǎn)，輕松實現(xiàn)臺面全覆蓋；

·        多達(dá)45個工作板位；

·        可實現(xiàn)震蕩、加熱/冷卻、吸頭清洗等功能；

·        開放式工作桌面，可輕松整合外部設(shè)備，如（自動PCR儀）。

圖2. Illumina PCR free DNA Library Prep 自動化工作流

使用Biomek i7工作站進(jìn)行 Illumina PCR free文庫構(gòu)建，輕松解放雙手，把更多的活交給工作站來進(jìn)行

表1.  Biomek i7 Hybrid Genomics Workstation自動化Illumina PCR free流程預(yù)估時間（大于100ng gDNA投入）

Method Options Selector (MOS）

MOS能夠選擇樣本數(shù)量、投入量、Index開始使用位置，以最大限度地提高靈活性、適應(yīng)性和方法執(zhí)行的簡易性。

圖3. Illumina PCR-Free建庫方法選項選擇器

Guided Labware Setup (GLS)

GLS基于MOS中選擇的選項生成的，并提供用戶特定的圖形設(shè)置說明，包括試劑體積計算和準(zhǔn)備試劑的分步說明。

圖4. 引導(dǎo)式實驗室設(shè)置提供配方注釋，指示試劑量（上圖），

并指導(dǎo)用戶正確設(shè)置平臺（下圖）

DeckOptixFinal Check (DFC)

在開始運行自動化流程之前，BML中的DFC功能，會通過實時拍照的方式分析工作桌面耗材擺放，以減少設(shè)置錯誤，例如吸頭、深孔板擺放位置錯誤。

實驗設(shè)計

為了證明在i7雙雜交工作站上進(jìn)行96個樣品文庫制備的能力，我們從人細(xì)胞系NA12878 gDNA制備文庫。將起始濃度為150 ng、300 ng、400 ng、500 ng和750 ng的48個gDNA樣本以及陰性模板對照（NTC）隨機放入96孔板，如下所示。

實驗結(jié)果

·        隨機挑取了23個 gDNA文庫進(jìn)行測序，平均插入片段為483bp±28bp

·        Reads mapping率為96.8%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1%

Biomek i7工作站上的Illumina  PCR free DNA文庫制備自動化是一個獨立的解決方案，為任何規(guī)模的實驗室提供了高效、靈活和可擴展的解決方案。自動化解決方案提供的文庫在下游工作流程中產(chǎn)生高質(zhì)量的結(jié)果，并節(jié)省了寶貴的時間和金錢。